Коротке обговорення хімічного синтезу олігонуклеотидних препаратів і фосфорних реагентів-CTPPA

(Фосфорні реагенти-CTPPA:2-Ціаноетил N,N,N',N'-тетраізопропілфосфородіаМідіт CAS №:102691-36-1)

Область лікарських засобів нуклеїнових кислот привернула значну увагу в останні роки. Схвалення та запуск препаратів на основі нуклеїнових кислот прискорилися, і ряд таких препаратів, які потенційно можуть стати популярними продуктами, оприлюднили клінічні дані, що охоплюють такі сфери, як серцево-судинні та метаболічні захворювання, захворювання печінки та різні рідкісні захворювання. Станом на перше півріччя 2025 року загалом 22 препарати малої кількості нуклеїнових кислот (включно з тими, які вже вилучені з ринку) було схвалено для маркетингу в усьому світі, включаючи 13 препаратів ASO, 7 препаратів siRNA і 2 препарати на основі лігандів-.

За класифікацією найбільшу питому вагу складають препарати АСО, 13 представлених на ринку препаратів становлять 59,09% від загальної кількості. Далі йдуть препарати siRNA, причому 7 представлених на ринку препаратів становлять 31,81%. З точки зору показань, 17 препаратів націлені на рідкісні генетичні захворювання, 3 — на офтальмологічні захворювання, 1 — на серцево-судинні захворювання, 1 — на онкологічні гематологічні ускладнення. Розподіл показань представляє схему «рідкісних захворювань як основного фокусу, з проривами в багатьох сферах». Очевидно, що клінічне застосування малих препаратів нуклеїнової кислоти поступово виходить за межі рідкісних захворювань на інші захворювання.

Зі зростанням досліджень лікарських засобів на основі нуклеїнових кислот широкомасштабне-виробництво різноманітних олігонуклеотидних препаратів поступово стане майбутнім трендом, серед яких хімічний синтез є основним методом синтезу коротко{1}}ланцюгових олігонуклеотидів. Пройшовши більш ніж півстолітній розвиток, методи хімічного синтезу олігонуклеотидів еволюціонували від початкового фосфодіефірного методу до фосфотріефірного методу та фосфітного методу, а потім до нині зрілого фосфорамідитного методу. Подібно до синтезу пептидів, синтез олігонуклеотидів також можна розділити на синтез у розчині-фазі та синтез-твердої фази з іншої точки зору. Ця стаття представляє найбільш часто використовувані «фосфорні реагенти» та їх застосування в синтезі нуклеозидних мономерів.

Рисунок 1. Фосфітилюючі реагенти та активуючі реагенти

У синтезі олігонуклеотидів отримання нуклеозидних мономерів є обов'язковим етапом. На даний момент існує два основних фосфітилюючі реагенти, які широко використовуються для синтезу різних нуклеозидних мономерів: один — 2-ціаноетил N,N-діізопропілхлорфосфорамідит (1) [1]; інший — біс(діізопропіламіно)(2-ціаноетокси)фосфін (2) (рис. 1) [2]. 2-ціаноетил N,N-діізопропілхлорфосфорамідит (1) демонструє найвищу реакційну здатність і легко конденсується зі спиртами. Навпаки, біс(діізопропіламіно)(2-ціаноетокси)фосфін (2) потребує активації in situ, що каталізується слабокислими реагентами, такими як тетразол, перш ніж він зможе піддатися конденсації зі спиртами (рис. 1). З практичної точки зору 2-ціаноетил N,N-діізопропілхлорфосфорамідіт (1) дорожчий, ніж біс(діізопропіламіно)(2-ціаноетокси)фосфін (2). Через високу реакційну здатність 2-ціаноетил N,N-діізопропілхлорфосфорамідит (1) більш схильний до деградації, що робить його використання та зберігання незручним. Він також схильний до введення додаткових домішок під час реакції, що призводить до менш ідеальної чистоти та виходу. Таким чином, біс(диізопропіламіно)(2-ціаноетокси)фосфін (2) на даний момент є найбільш поширеним фосфітилюючим реагентом для отримання нуклеозидних мономерів, і його часто називають «фосфорним реагентом».

Рисунок 2. Механізм реакції каталізованого тетразол-фосфітилювання

У процесі конденсації між «фосфорними реагентами» та спиртами зазвичай додається стехіометрична або суб{0}}стехіометрична кількість активуючого реагенту. Найбільш часто використовувані активуючі реагенти включають тетразол, 4,5-діціаноімідазол і піридиній трифторацетат [3,4]. В даний час механізм реакції конденсації між «фосфорними реагентами» і спиртами, що каталізується тетразолом, досконально вивчений [5-7].

Реакція протікає наступним чином: спочатку відбувається протонування «фосфорного реактиву»; потім діізопропіламін замінюють тетразолом; згодом тетразол замінюють спиртом (рис. 2). Серед цих етапів заміщення диізопропіламіну тетразолом є етапом-визначання швидкості.

Серед трьох вищезгаданих активуючих реагентів тетразол має найсильнішу кислотність (pKa=4.89) [3], яку можна порівняти з оцтовою кислотою (pKa=4.74). Навпаки, 4,5-діціаноімідазол (pKa=5.20) [3] і піридиній трифторацетат (pKa=5.23) ​​[3] демонструють слабкішу кислотність.

Оскільки 5'-гідроксильна група в нуклеозидних мономерах зазвичай захищена кислотно-лабільною 4,4'-диметокситритиловою (ДМТ) групою, використання тетразолу може супроводжуватися побічною реакцією зняття захисту з ДМТ. Тому 4,5-діціаноімідазол (pKa=5.20) і піридиній трифторацетат (pKa=5.23) іноді є більш ідеальним вибором.

Крім того, Koch et al. повідомили, що коли 4,5-діціаноімідазол використовується як активуючий реагент, повна конверсія може бути досягнута лише з 0,7 еквівалентами реагенту. Навпаки, використання більше ніж 1 еквівалента схильне до утворення димерних побічних продуктів [4].

Властивості "Phosphorus Reagent-CTPPA"

«Фосфорний реагент» — безбарвна або блідо-жовта рідина з відносно високою температурою кипіння (115 градусів /0,6 Торр). Він чутливий як до кисню, так і до вологи та легко розкладається під час вакуумної дистиляції, що ускладнює-велике виробництво цього продукту. Між тим, через його особливі властивості, перевірка якості фосфорного реактиву також представляє значні труднощі. Для користувачів після кожного використання реагент слід захистити азотом і зберігати в ексикаторі. Така практика може продовжити термін служби реагенту.

Наша компанія займається дослідженнями та розробкою та виробництвом фосфорного реагенту протягом майже десятиліття, накопичивши великий досвід у виробництві та тестуванні продукту. Наразі ми можемо постачати-"фосфорний реагент" високої чистоти в кілограмовому масштабі. Крім того, ми також пропонуємо супутні продукти, такі як тетразол і 4,5-діціаноімідазол. Ми запрошуємо друзів із відповідними потребами зв’язатися з нами (Таблиця 1).

Таблиця 1 Відповідні продукти, які виробляє та продає наша компанія

Список літератури

[1] Сінха, Н.Д.; МакМанус, Дж.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] Нільсен, Дж.; Таагаард, М.; Marugg, JE та ін. Nucleic Acids Research 1986, 14, 7391.

[3] Сангві, Ю.С.; Го, З.; Pfundheller, HM та ін. Organic Process Research Development 2000, 4, 175.

[4] Педерсен Д.С.; Rosenbohm C.; Кох Т. Синтез 2002, 802.

[5] Нурмінен, EJ; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] Бернер, С.; Мюлеггер, К.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] Даль, Б.М.; Нільсен, Дж.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.